Το διαγονιδιακό αγελαδινό γάλα έχει αποκτήσει νέο ρόλο στη μάχη κατά του διαβήτη. Ερευνητές στη Βραζιλία κατάφεραν να παράγουν διαγονιδιακές αγελάδες που εκφράζουν το γονίδιο της ανθρώπινης ινσουλίνης στο γάλα τους. Η πρωτοποριακή αυτή μελέτη, που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Biotechnology Journal, ανοίγει νέους ορίζοντες για την αντιμετώπιση του διαβήτη, μιας ασθένειας που πλήττει εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως. Ωστόσο, η έρευνα εγείρει και προβληματισμούς σχετικά με τις επιπτώσεις των γενετικά τροποποιημένων ζώων.
Ιστορικό
Ο διαβήτης αποτελεί μια από τις ταχύτερα αυξανόμενες απειλές για την παγκόσμια υγεία. Σύμφωνα με εκτιμήσεις του 2021, περισσότεροι από 500 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως πάσχουν από διαβήτη τύπου 1 ή τύπου 2, και ο αριθμός αυτός αναμένεται να αυξηθεί δραματικά τις επόμενες δύο δεκαετίες. Ο διαβήτης τύπου 1 οφείλεται σε ανεπάρκεια ινσουλίνης λόγω αυτοάνοσης καταστροφής των β-κυττάρων του παγκρέατος, ενώ ο διαβήτης τύπου 2 προκαλείται από αντίσταση στην ινσουλίνη και την επακόλουθη επίδρασή της στην έκκριση ινσουλίνης από τα β-κύτταρα.
Η ινσουλίνη για θεραπευτική χρήση στον άνθρωπο παράγεται με τη χρήση μικροοργανισμών όπως το βακτήριο Escherichia coli, η ζύμη και διαγονιδιακά ποντίκια. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι παρουσιάζουν περιορισμούς ως προς την κλιμάκωση της παραγωγής για την κάλυψη των αυξανόμενων αναγκών. Τα διαγονιδιακά ζώα θεωρούνται μια ελκυστική εναλλακτική για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα, με το γάλα να αποτελεί σε πολλές περιπτώσεις έναν πιο συμφέροντα τρόπο παραγωγής.
Η χρήση συγκεκριμένων υποκινητών για τους μαστικούς αδένες επιτρέπει τον χειρισμό της έκφρασης των ετερόλογων πρωτεϊνών στο γάλα. Οι αγελάδες παράγουν μεγάλες ποσότητες γάλακτος για μεγάλο χρονικό διάστημα, επομένως οι διαγονιδιακές αγελάδες μπορούν να θεωρηθούν σημαντικοί βιοαντιδραστήρες για την έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στο γάλα. Η μεταφορά πυρήνων σωματικών κυττάρων (SCNT) έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων, αν και η αποτελεσματικότητά της παραμένει χαμηλή και απαιτείται μεγάλο χρονικό διάστημα μέχρι την έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης.
Διαγονιδιακό αγελαδινό γάλα για παραγωγή ανθρώπινης προϊνσουλίνης
Σε μια πρωτοποριακή μελέτη, ερευνητές από τη Βραζιλία κατάφεραν να παράγουν διαγονιδιακές αγελάδες που εκφράζουν την ανθρώπινη προϊνσουλίνη στο γάλα τους. Η προσέγγιση περιελάμβανε την κατασκευή ενός λεντιϊικού φορέα που περιείχε τον υποκινητή της βόειας β-καζεΐνης και τις αλληλουχίες της ανθρώπινης ινσουλίνης. Ο φορέας αυτός χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία τροποποιημένων ενήλικων ινοβλαστών, οι οποίοι στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για πυρηνική μεταφορά, όπως περιγράφουν οι Monzani et al. στο άρθρο τους “Human proinsulin production in the milk of transgenic cattle” που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Biotechnology Journal.
Η αξιολόγηση της κατασκευής του φορέα πριν από τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων είναι ζωτικής σημασίας, δεδομένου του μεγάλου χρονικού διαστήματος που μεσολαβεί μεταξύ της κατασκευής του φορέα και της ανάλυσης της πρωτεΐνης στο γάλα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν αθανατοποιημένα κύτταρα μαστικού επιθηλίου (MAC-T) που καλλιεργήθηκαν σε πολυστυρένιο και επάχθηκαν με λακτογόνες ορμόνες.
Τα τροποποιημένα κύτταρα που επιλέχθηκαν μετά από επιλογή με βλαστισιδίνη χρησιμοποιήθηκαν ως δότες πυρήνων για τη μεταφορά πυρήνων σωματικών κυττάρων (SCNT). Δέκα έμβρυα μεταφέρθηκαν σε συγχρονισμένους αποδέκτες και η εγκυμοσύνη αξιολογήθηκε με υπερηχογράφημα την 60η ημέρα. Ένας μόσχος γεννήθηκε φυσιολογικά και ήταν ζωντανός.
Η PCR ανάλυση και η καλλιέργεια ινοβλαστών του μόσχου σε μέσο με βλαστισιδίνη επιβεβαίωσαν την παρουσία του διαγονιδίου. Ωστόσο, παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες, συμπεριλαμβανομένης της τεχνητής γονιμοποίησης, της in vitro γονιμοποίησης και της φυσικής σύζευξης, δεν κατέστη δυνατή η επίτευξη εγκυμοσύνης στη διαγονιδιακή αγελάδα. Αυτό υποδηλώνει ότι το αποτέλεσμα θα μπορούσε να οφείλεται περισσότερο στην τεχνική SCNT παρά στη διαγονιδιακή τροποποίηση καθαυτή.
Παρά τις προκλήσεις, η μελέτη αποτελεί ένα σημαντικό βήμα προς την κατεύθυνση της παραγωγής ανθρώπινης ινσουλίνης σε αγελαδινό γάλα. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας και τη διασφάλιση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας του τελικού προϊόντος πριν από οποιαδήποτε πιθανή κλινική εφαρμογή. Είναι επίσης σημαντικό να εξεταστούν προσεκτικά τα ηθικά ζητήματα που σχετίζονται με τη χρήση διαγονιδιακών ζώων για την παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων για ανθρώπινη χρήση.
Ανάλυση ανθρώπινης προϊνσουλίνης και ινσουλίνης σε διαγονιδιακό γάλα
Η επαγωγή της γαλουχίας στη διαγονιδιακή αγελάδα πραγματοποιήθηκε με ορμονική θεραπεία, καθώς δεν ήταν δυνατή η επίτευξη εγκυμοσύνης. Ωστόσο, η ανταπόκριση στην επαγωγή ήταν ανεπαρκής για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων γάλακτος και μόνο μικρές ποσότητες συλλέχθηκαν για περίπου ένα μήνα. Τα δείγματα γάλακτος χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της παρουσίας της ανθρώπινης πρωτεΐνης στο γάλα της διαγονιδιακής αγελάδας με ανάλυση Western blotting και φασματομετρία μάζας.
Η ανάλυση Western blotting, όπως περιγράφεται στη μελέτη των Monzani et al. “Human proinsulin production in the milk of transgenic cattle”, υπέδειξε δύο διακριτές ζώνες που βρέθηκαν στο γάλα της διαγονιδιακής αγελάδας και δεν παρατηρήθηκαν στο γάλα της μη διαγονιδιακής αγελάδας, με κατά προσέγγιση μοριακή μάζα προϊνσουλίνης και ανθρώπινης ινσουλίνης, υποδηλώνοντας την παρουσία της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με πιθανή μετατροπή της προϊνσουλίνης σε ινσουλίνη.
Για την επιβεβαίωση της παρουσίας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, δείγματα γάλακτος από μη διαγονιδιακές και διαγονιδιακές αγελάδες αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας. Η ανάλυση αυτή επέτρεψε την ταυτοποίηση ενός πεπτιδίου που αντιστοιχούσε στο C-πεπτίδιο της ανθρώπινης ινσουλίνης, το οποίο διαφέρει σε μάζα από την αγελαδινή ινσουλίνη. Το C-πεπτίδιο που βρέθηκε στη φασματομετρία μάζας αποτελούνταν από 28 αμινοξέα, σε αντίθεση με τα 31 αμινοξέα που αναφέρονται συνήθως. Αν και δεν περιγράφεται, το πεπτίδιο των 28 αμινοξέων μπορεί να προκύψει από εναλλακτικό μάτισμα.
Η ταυτοποίηση του C-πεπτιδίου επιβεβαιώνει την παρουσία της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στο γάλα της διαγονιδιακής αγελάδας και υποδηλώνει ότι η προϊνσουλίνη θα μπορούσε να μετατραπεί σε ινσουλίνη από πρωτεάσες του γάλακτος ή από τη θρυψίνη που χρησιμοποιήθηκε στην επεξεργασία για τη φασματομετρία μάζας. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ήταν χαμηλά σε σχέση με τις πρωτεΐνες του γάλακτος, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην παρουσία πρωτεασών που αποικοδομούν την ινσουλίνη, όπως η IDE (ένζυμο αποικοδόμησης ινσουλίνης), η οποία ανιχνεύθηκε σε αφθονία στο διαγονιδιακό γάλα.
Παρά τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης, η μελέτη αποδεικνύει τη δυνατότητα παραγωγής ανθρώπινης ινσουλίνης σε αγελαδινό γάλα διαγονιδιακών ζώων. Η φασματομετρία μάζας αποδείχθηκε αποτελεσματική μέθοδος για την ανίχνευση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με χαμηλή έκφραση στο γάλα. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για τη βελτιστοποίηση της έκφρασης και τη διερεύνηση του ρόλου των πρωτεασών του γάλακτος στην επεξεργασία και την αποικοδόμηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης.
Επίλογος
Η πρωτοποριακή έρευνα για την παραγωγή ανθρώπινης ινσουλίνης σε αγελαδινό γάλα διαγονιδιακών αγελάδων ανοίγει νέους ορίζοντες στην αντιμετώπιση του διαβήτη. Παρά τις προκλήσεις και τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, η μελέτη αποδεικνύει τη δυνατότητα παραγωγής λειτουργικής ανθρώπινης ινσουλίνης στο γάλα διαγονιδιακών ζώων. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για τη βελτιστοποίηση της διαδικασίας, τη διασφάλιση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας, καθώς και για την αντιμετώπιση των ηθικών ζητημάτων που σχετίζονται με τη χρήση διαγονιδιακών ζώων στην παραγωγή φαρμάκων. Η συνεχιζόμενη πρόοδος σε αυτόν τον τομέα θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέες, πιο προσιτές και αποτελεσματικές θεραπείες για τους εκατομμύρια ανθρώπους που πάσχουν από διαβήτη παγκοσμίως.
Βιβλιογραφία
Monzani, Paulo S., et al. “Human proinsulin production in the milk of transgenic cattle.” Biotechnology Journal, vol. 18, no. 3, 12 March 2024
Για αυτό το άρθρο χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινος παράγοντας και τεχνητή νοημοσύνη. Δείτε τους Όρους Χρήσης της ιστοσελίδας.